Cómo preparar una solución salina tamponada con fosfato

La disolución salina tamponada con fosfato, o disolución PBS, por sus siglas en inglés, es una disolución reguladora de pH comúnmente utilizada en los laboratorios de biología en todo el mundo. Se trata de una disolución de distintas sales que posee como sistema buffer el par ácido/base dihidrógeno fosfato/hidrógeno fosfato (H₂PO₄^-/ HPO₄^–). Este sistema buffer es ideal para llevar a cabo experimentos de índole biológico y médico ya que el dihidrógeno fosfato (también llamado fosfato diácido) tiene un pKa de 7,2, por lo que una disolución equimolar del par conjugado regula el pH en torno a 7,2, simulando adecuadamente el pH fisiológico humano.

Además de modelar correctamente el pH de distintos fluidos corporales, la disolución PBS también tiene algunas sales disueltas, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio y en algunos casos cloruro de calcio y de magnesio. En conjunto, las sales y los fosfatos proporcionan a la disolución una osmolaridad equivalente a la del plasma sanguíneo (alrededor de 290 mOsm/L), convirtiéndola en una disolución isotónica, ideal para estudiar células y otros sistemas en condiciones fisiológicas.

Composición del buffer PBS

Existen distintas formulaciones que entran dentro de la categoría de disolución salina tamponada con fosfato.

Como mínimo, esta disolución debe contener cloruro de sodio como sal principal (de donde viene el término disolución salina) y además debe contener por lo menos una sal de uno de los dos componentes del sistema buffer. Podría ser dihidrógeno fosfato de sodio o de potasio, o también podría utilizarse hidrógeno fosfato de sodio o de potasio.

En el primer caso, se debe añadir también una base fuerte tal como hidróxido de sodio para neutralizar la mitad de la sal ácida y poder generar así el sistema buffer completo. En el segundo caso, comenzamos en presencia únicamente de la sal básica, así que debemos neutralizar la mitad para así generar suficiente ácido conjugado.

Un ejemplo típico de la composición de una de estas disoluciones PBS es:

• Cloruro de sodio (NaCl) 140 mM.
• Hidrógeno fosfato de sodio 12 mM.
• Ácido clorhídrico hasta alcanzar el pH deseado.

Sin embargo, en el caso más común, la disolución PBS trata de simular lo mejor posible las características de los fluidos biológicos, lo cual incluye otros iones además de sodio, los distintos fosfatos y cloruros. Por esta razón, las disoluciones PBS suelen ser ligeramente más complejas que lo descrito anteriormente. En las soluciones cuya preparación se describe más adelante, las concentraciones finales de las especies iónicas relevantes antes de ajustar el pH son:

La concentración particular de los iones hidrógeno fosfato (HPO₄^2-) y dihidrógeno fosfato (H₂PO₄^–), las especies dominantes en equilibrio a valores de pH cercanos a 7, dependerá del pH particular al que se ajuste la disolución. Por ejemplo, si el pH se lleva hasta 7,2, el pKa del dihidrógeno fosfato, ambos iones estarán en una proporción 1:1 con concentraciones de alrededor de 5,9 mM.

A continuación se presenta el protocolo para la preparación de una disolución PBS típica para el uso en el laboratorio que, además de fosfatos, cloruros y iones sodio, también contiene iones potasio, calcio y magnesio.

Preparación de disolución salina tamponada con fosfato

Hay dos maneras típicas de preparar una disolución PBS para su uso en un laboratorio de biología, medicina o bioquímica: por pesaje y disolución directa de las sales necesarias, o por dilución de una disolución más concentrada.

Ambos procedimientos dan el mismo resultado, pero el segundo resulta mucho más práctico en laboratorios en los que se utiliza esta disolución con mucha frecuencia. Esto se debe a que, con la preparación de tan solo una disolución concentrada, se puede preparar rápidamente cualquier dilución requerida al momento que se necesite, procedimiento que es mucho más rápido y menos propenso a errores que pesar y disolver de 4 a 6 sales diferentes cada vez que se deba preparar una disolución.

Preparación de una disolución PBS 1x por pesaje directo

La siguiente tabla contiene las masas de los distintos componentes que se deben pesar para preparar 250 mL, 500 mL y 1 L de disolución PBS estándar con un pH de entre 7,2 y 7,4 y una osmolaridad de aproximadamente 290 mOsm/L. A esta disolución se le suele denominar PBS 1x ya que es la que posee la concentración adecuada para su uso en experimentos.

Protocolo de preparación

La preparación de estas disoluciones se lleva a cabo por medio de los siguientes pasos:

1. Se pesan por separado todas las sales utilizando una balanza analítica.
2. En un beaker o vaso de precipitado de tamaño adecuado, agregue agua hasta completar las cuatro quintas partes del volumen total de la solución que se desea preparar (200 mL de agua para la disolución de 250 mL, 400 mL para la disolución de 500 mL o 800 mL para la disolución de 1 L). De ser posible, utilice agua ultra pura (desionizada). No es necesario medir esta cantidad de agua con demasiada exactitud.
3. Agregue una a una las sales previamente pesadas y agite con un agitador magnético o con una varilla de vidrio hasta disolver completamente. La disolución resultante debería tener un pH más alcalino de alrededor de 7,8 o 7,9.
4. Utilizando un pH-metro o medidor de pH y bajo agitación constante, añada una disolución de ácido clorhídrico (HCl) 0,1 M hasta alcanzar el pH deseado. Para alcanzar un pH de alrededor de 7,4 en la disolución de 1 L se necesitarán cerca de 30 mL de HCl 0,1 M. Para las otras dos se necesitarán cantidades proporcionalmente menores.
5. Una vez alcanzado el pH deseado, trasvasar la disolución a un balón aforado de capacidad adecuada (250 mL, 500 mL o 1 L, según sea el caso).
6. Una vez en el balón aforado, añadir agua ultra pura hasta la marca de aforo.
7. Con el tapón del balón en su lugar, agitar la disolución para asegurar la homogeneidad de la misma.

Preparación de una disolución PBS 10x por pesaje directo

La disolución PBS 10x es una versión diez veces más concentrada de la disolución estándar. Esta disolución no se utiliza para llevar a cabo experimentos, sino como solución concentrada para preparar la disolución estándar por dilución.

La siguiente tabla contiene las masas de los distintos componentes que se deben pesar para preparar 250 mL, 500 mL y 1 L de disolución PBS 10x con un pH de entre 7,2 y 7,4 y una osmolaridad de aproximadamente 2,90 Osm/L.

Protocolo de preparación

La preparación de cualquiera de las disoluciones concentradas se lleva a capo siguiendo los mismos pasos que en el caso anterior. Los únicos cambios importantes son las masas de los solutos, que son diez veces mayores.

Por otro lado, por tratarse de una disolución mucho más concentrada, el ajuste del pH se debe llevar a cabo también con una disolución de HCl más concentrada, preferiblemente 1 M. No se debe llevar a cabo con la misma disolución 0,1 M, ya que el volumen que se necesitará para alcanzar un pH de entre 7,2 y 7,4 acabará superando el volumen total final de la disolución que se desea preparar.

Preparación de la disolución PBS 1x por dilución de la disolución 10x

La disolución concentrada 10x descrita en el apartado anterior se utiliza como stock o solución madre para la preparación en el momento de cantidades pequeñas de disolución PBS 1x. La siguiente tabla indica las cantidades de solución concentrada que se deben medir según la cantidad de disolución PBS 1x que se desea preparar.

Protocolo de preparación

En todos los casos, la preparación de las diluciones requiere el uso de una pipeta volumétrica cuya capacidad sea igual al volumen de la solución 10x que se va a medir, así como un balón aforado cuyo volumen sea igual a la cantidad de solución que se desea preparar.

Los pasos son los siguientes:

1. Verificar que la disolución concentrada no haya precipitado. De ser así, agitarla hasta disolver completamente.
2. Verter en un vaso de precipitado de tamaño adecuado una cantidad ligeramente mayor de la solución PBS 10x que se debe medir.
3. Con el uso de una pipeta volumétrica de volumen adecuado (como se describió anteriormente) medir el volumen correspondiente de la disolución concentrada y agregarlo al balón aforado adecuado.
4. Agregar agua hasta la marca de aforo.
5. Con el tapón del balón en su lugar, agitar la disolución para asegurar la homogeneidad de la misma.

Esterilización y almacenamiento de las disoluciones PBS

A pesar de que estas disoluciones casi siempre se pueden utilizar inmediatamente después de preparadas, algunas aplicaciones de la disolución salina tamponada con fosfatos requieren que la misma sea esterilizada primero. En estos casos, una esterilización de 20 minutos en autoclave a 15 psi es suficiente.

En cuanto al almacenamiento, tanto las disoluciones PBS 1x como la 10x se pueden almacenar a temperatura ambiente.

De ser necesario, también se pueden almacenar bajo refrigeración para prolongar su vida útil. En el caso de la disolución estándar, el enfriamiento no causa ningún tipo de problema. Sin embargo, en el caso de la disolución 10x, por ser una disolución relativamente concentrada, el enfriamiento puede causar la precipitación de algunas sales, en especial si la disolución contiene calcio y magnesio.

La precipitación normalmente no es un problema, siempre y cuando se tomen medidas para volver a disolver todos los solutos antes de utilizar esta disolución para preparar las respectivas diluciones. Para lograr esto, basta con dejar que la disolución alcance la temperatura ambiente y luego agitarla hasta disolver todos los sólidos formados. De ser necesario, también se puede calentar la disolución ligeramente para lograr disolver los solutos más rápidamente.

Referencias

AAT Bioquest, Inc. (2021, October 20). PBS (Phosphate Buffered Saline) (1X, pH 7.4).». Retrieved from https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/pbs-phosphate-buffered-saline

Checa R., A. (2017, 13 diciembre). Método: Disolución amortiguadora de fosfatos (PBS). Conogasi. http://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-amortiguadora-de-fosfatos-pbs/

Gil, M. (2019, 17 abril). Buffer de fosfatos (PBS): fundamento, preparación y usos. Lifeder. https://www.lifeder.com/buffer-fosfatos/