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La soluzione salina tamponata con fosfato, o soluzione PBS, è una soluzione tampone di pH comunemente utilizzata nei laboratori di biologia di tutto il mondo. È una soluzione di diversi sali che ha come sistema tampone la coppia acido/base fosfato diidrogeno/fosfato di idrogeno (H 2 PO 4 -/ HPO 4 – ). Questo sistema tampone è ideale per effettuare esperimenti di natura biologica e medica, poiché il diidrogeno fosfato (detto anche diacido fosfato) ha un pKa di 7.2, quindi una soluzione equimolare della coppia coniugata regola il pH intorno a 7. .2, simulando adeguatamente il pH fisiologico umano.
Oltre a modellare correttamente il pH di vari fluidi corporei, la soluzione PBS ha anche alcuni sali disciolti, come cloruro di sodio, cloruro di potassio e in alcuni casi cloruro di calcio e magnesio. Insieme, i sali ei fosfati forniscono alla soluzione un’osmolarità equivalente a quella del plasma sanguigno (circa 290 mOsm/L), rendendola una soluzione isotonica, ideale per studiare cellule e altri sistemi in condizioni fisiologiche.
Composizione del tampone PBS
Esistono diverse formulazioni che rientrano nella categoria della soluzione salina tamponata con fosfato.
Tale soluzione deve contenere come minimo cloruro di sodio come sale principale (da cui deriva il termine soluzione salina) e deve inoltre contenere almeno un sale di uno dei due componenti del sistema tampone. Potrebbe essere fosfato monobasico di sodio o di potassio, o anche fosfato bibasico di sodio o potassio.
Nel primo caso si deve aggiungere anche una base forte come l’idrossido di sodio per neutralizzare metà del sale acido e generare così il sistema tampone completo. Nel secondo caso, si parte in presenza del solo sale basico, quindi bisogna neutralizzarne metà per generare abbastanza acido coniugato.
Un tipico esempio della composizione di una di queste soluzioni PBS è:
- Cloruro di sodio (NaCl) 140 mM.
- idrogenofosfato di sodio 12 mM.
- Acido cloridrico fino al raggiungimento del pH desiderato.
Tuttavia, nel caso più comune, la soluzione PBS cerca di simulare il più possibile le caratteristiche dei fluidi biologici, che comprendono ioni diversi dal sodio, i vari fosfati e cloruri. Per questo motivo, le soluzioni PBS sono generalmente leggermente più complesse di quanto descritto sopra. Nelle soluzioni la cui preparazione è descritta di seguito, le concentrazioni finali delle relative specie ioniche prima della regolazione del pH sono:
Ione | Concentrazione (mm) |
No + | 157 |
K + | 4.5 |
Ca2 + | 1 |
mg2 + | 0,5 |
Cl – | 142,7 |
fosfati | 11.8 |
La particolare concentrazione di ioni idrogeno fosfato (HPO 4 2- ) e diidrogeno fosfato (H 2 PO 4 – ) , le specie dominanti in equilibrio a valori di pH prossimi a 7, dipenderà dal particolare pH a cui la soluzione è regolata. Ad esempio, se il pH viene portato a 7,2, il pKa del diidrogeno fosfato, entrambi gli ioni saranno in rapporto 1:1 con concentrazioni intorno a 5,9 mM.
Di seguito è riportato il protocollo per la preparazione di una tipica soluzione PBS per uso di laboratorio che, oltre a fosfati, cloruri e ioni sodio, contiene anche ioni potassio, calcio e magnesio.
Preparazione di soluzione salina tamponata con fosfato
Esistono due modi tipici per preparare una soluzione PBS da utilizzare in un laboratorio di biologia, medicina o biochimica: pesando e dissolvendo direttamente i sali necessari o diluendo una soluzione più concentrata.
Entrambe le procedure danno lo stesso risultato, ma la seconda è molto più pratica nei laboratori dove questa soluzione viene utilizzata frequentemente. Questo perché, preparando una sola soluzione concentrata, è possibile preparare rapidamente qualsiasi diluizione richiesta al momento necessario, una procedura molto più rapida e meno soggetta a errori rispetto alla pesatura e alla dissoluzione di 4-6 sali diversi. deve essere preparato.
Preparazione di una soluzione PBS 1x mediante pesatura diretta
La tabella seguente contiene le masse dei diversi componenti che devono essere pesate per preparare 250 mL, 500 mL e 1 L di soluzione PBS standard con un pH compreso tra 7,2 e 7,4 e un’osmolarità di circa 290 mOsm/L. Questa soluzione è solitamente chiamata PBS 1x poiché è quella con la concentrazione appropriata per l’uso negli esperimenti.
soluto | Massa molare del soluto (g/mol) | Massa del soluto (g) per 250 ml (g) | Massa del soluto (g) per 500 ml | Massa del soluto (g) per 1 L | Concentrazione nominale (mM) |
NaCl | 58.44 | 2.002 | 4.003 | 8.006 | 137 |
KCl | 74.548 | 0,050 | 0.101 | 0.201 | 2.7 |
Na2HPO4 _ _ _ | 141.958 | 0,355 | 0,710 | 1.420 | 10 |
KH 2 PO 4 | 136.084 | 0,061 | 0,122 | 0,245 | 1.8 |
CaCl 2 • 2H 2 O (opzionale) | 147.008 | 0,037 | 0,074 | 0,147 | 1 |
MgCl 2 • 6H 2 O (opzionale) | 203,295 | 0,025 | 0,051 | 0.102 | 0,5 |
protocollo di preparazione
La preparazione di queste soluzioni viene effettuata mediante le seguenti fasi:
- Tutti i sali vengono pesati separatamente utilizzando una bilancia analitica.
- In un bicchiere o bicchiere di dimensioni adeguate, aggiungere acqua fino a quattro quinti del volume totale della soluzione da preparare (200 mL di acqua per la soluzione da 250 mL, 400 mL per la soluzione da 500 mL o Se possibile, utilizzare acqua ultrapura (deionizzata). Non è necessario misurare questa quantità di acqua in modo molto accurato.
- Aggiungere uno ad uno i sali precedentemente pesati e agitare con un agitatore magnetico o una bacchetta di vetro fino a completa dissoluzione. La soluzione risultante dovrebbe avere un pH più alcalino di circa 7,8 o 7,9.
- Utilizzando un pHmetro o un pHmetro e sotto costante agitazione, aggiungere una soluzione di acido cloridrico (HCl) 0,1 M fino a raggiungere il pH desiderato. Per raggiungere un pH di circa 7,4 nella soluzione da 1 L, saranno necessari circa 30 mL di HCl 0,1 M. Per gli altri due, saranno necessarie quantità proporzionalmente inferiori.
- Una volta raggiunto il pH desiderato, trasferire la soluzione in un matraccio tarato di capacità adeguata (250 mL, 500 mL o 1 L, a seconda dei casi).
- Una volta nel matraccio tarato, aggiungere acqua ultrapura fino al segno di misurazione.
- Con il tappo del palloncino in posizione, agitare la soluzione per assicurarsi che sia omogenea.
Preparazione di una soluzione PBS 10x mediante pesatura diretta
La soluzione 10x PBS è una versione dieci volte più concentrata della soluzione standard. Questa soluzione non viene utilizzata per eseguire esperimenti, ma come soluzione concentrata per preparare la soluzione standard per diluizione.
La tabella seguente contiene le masse dei diversi componenti che devono essere pesate per preparare 250 mL, 500 mL e 1 L di soluzione PBS 10x con un pH compreso tra 7,2 e 7,4 e un’osmolarità di circa 2,90 Osm/L.
soluto | Massa molare del soluto (g/mol) | Massa del soluto (g) per 250 ml (g) | Massa del soluto (g) per 500 ml | Massa del soluto (g) per 1 L | Concentrazione nominale (mM) |
NaCl | 58.44 | 20.0157 | 40.0314 | 80.0628 | 1370 |
KCl | 74.548 | 0,503199 | 1.006398 | 2.012796 | 27 |
Na2HPO4 _ _ _ | 141.958 | 3.54895 | 7.0979 | 14,1958 | 100 |
KH 2 PO 4 | 136.084 | 0,612378 | 1.224756 | 2.449512 | 18 |
CaCl 2 • 2H 2 O (opzionale) | 147.008 | 0,36752 | 0,73504 | 1.47008 | 10 |
MgCl 2 • 6H 2 O (opzionale) | 203,295 | 0,25411875 | 0,5082375 | 1.016475 | 5 |
protocollo di preparazione
La preparazione di una qualsiasi delle soluzioni concentrate viene effettuata seguendo le stesse fasi del caso precedente. Gli unici cambiamenti importanti sono le masse dei soluti, che sono dieci volte maggiori.
D’altra parte, trattandosi di una soluzione molto più concentrata, la regolazione del pH va effettuata anche con una soluzione di HCl più concentrata, preferibilmente 1 M. Non va effettuata con la stessa soluzione 0,1 M, poiché il volume che sarà necessario per raggiungere un pH compreso tra 7,2 e 7,4 finirà per superare il volume totale finale della soluzione che si vuole preparare.
Preparazione della soluzione PBS 1x mediante diluizione della soluzione 10x
La soluzione concentrata 10x descritta nella sezione precedente viene utilizzata come soluzione madre o madre per la preparazione in loco di piccole quantità di soluzione PBS 1x. La tabella seguente indica le quantità di soluzione concentrata che devono essere misurate in base alla quantità di soluzione PBS 1x che si desidera preparare.
Volume di 1x PBS da preparare (mL) | Volume di 10x PBS da misurare (mL) |
10 | 1 |
25 | 2.5 |
cinquanta | 5 |
100 | 10 |
250 | 25 |
500 | cinquanta |
1000 | 100 |
protocollo di preparazione
In tutti i casi, la preparazione delle diluizioni richiede l’utilizzo di una pipetta volumetrica la cui capacità sia pari al volume della soluzione 10x da misurare, nonché di un matraccio tarato il cui volume sia pari alla quantità di soluzione desiderata. preparare.
I passaggi sono i seguenti:
- Verificare che la soluzione concentrata non sia precipitata. In tal caso, agitalo fino a completo scioglimento.
- Versare una quantità leggermente maggiore della soluzione PBS 10x da misurare in un bicchiere di dimensioni adeguate.
- Utilizzando una pipetta volumetrica adatta (come descritto sopra) misurare il volume corrispondente della soluzione madre e aggiungerlo al pallone tarato appropriato.
- Aggiungere acqua fino al segno di capacità.
- Con il tappo del palloncino in posizione, agitare la soluzione per assicurarsi che sia omogenea.
Sterilizzazione e conservazione delle soluzioni PBS
Sebbene queste soluzioni possano quasi sempre essere utilizzate immediatamente dopo la preparazione, alcune applicazioni di soluzione salina tamponata con fosfato richiedono che venga prima sterilizzata. In questi casi è sufficiente una sterilizzazione di 20 minuti in autoclave a 15 psi.
Per quanto riguarda la conservazione, entrambe le soluzioni PBS 1x e 10x possono essere conservate a temperatura ambiente.
Se necessario, possono anche essere conservati in frigorifero per prolungarne la durata. Nel caso della soluzione standard, il raffreddamento non crea alcun problema. Tuttavia, nel caso della soluzione 10x, essendo una soluzione relativamente concentrata, il raffreddamento può causare la precipitazione di alcuni sali, soprattutto se la soluzione contiene calcio e magnesio.
La precipitazione normalmente non è un problema, purché vengano prese misure per ridissolvere tutti i soluti prima di utilizzare questa soluzione per preparare le rispettive diluizioni. Per ottenere ciò, è sufficiente lasciare che la soluzione raggiunga la temperatura ambiente e quindi agitarla fino a quando tutti i solidi formatisi sono dissolti. Se necessario, la soluzione può anche essere leggermente riscaldata per aiutare a dissolvere i soluti più rapidamente.
Riferimenti
AAT Bioquest, Inc. (2021, 20 ottobre). PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) (1X, pH 7,4).» . Estratto da https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/pbs-phosphate-buffered-saline
Checa R., A. (2017, 13 dicembre). Metodo: soluzione tampone fosfato (PBS) . Sapere. http://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-amortiguadora-de-fosfastos-pbs/
Gil, M. (2019, 17 aprile). Tampone fosfato (PBS): fondamento logico, preparazione e usi . ergastolano. https://www.lifeder.com/buffer-fosfati/